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【干货】送您一份磁珠分离细胞方法

人阅读 发布时间:2019-09-10 19:33

磁珠分离细胞原理:磁珠法分离细胞先将磁珠偶联抗体,通过抗体与细胞结合,再将结合好的细胞悬液置于磁场中,链接磁珠的细胞则被磁场吸附,未链接则被置于上清液中,从而实现细胞分离。
本方法以羧菲生物生产,100 纳米、高饱和磁化强度(>60eum/g)的羧基磁珠作为载体,通过偶联 CD11a+ 抗体与细胞结合,从而实现分离。

一、材料与方法

1.1免疫磁珠制备
  1. 活化:以 PH6.0,0.01mol/L 的 NaH2PO4 吐温(0.05% Tween—20)溶液作为活化缓冲液,取 2mg 羧基磁珠于 2ml 离心管中,加入 500ul 活化缓冲液,混合均匀,再将离心管放置于多功能磁分离架(奥润 MS-12)上,待磁珠完全被吸附,用微型台式真空泵把上清液抽提掉;加入 500ul 活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍后,向磁珠中加入485ul活化缓冲液,再分别加入 2.5mg 碳二亚胺(EDC,原浓度 0.5g/ml)与N—羟基琥珀酰亚胺(NHS,原浓度 0.25g/ml),混合均匀,室温活化 2mg 磁珠表面的羧基 3min。
  2. 偶联:以 500ul,PH7.4,0.01mol/L 的磷酸盐吐温(PBST,0.05%Tween—20)溶液作偶联缓冲液,加 500ul 的活化缓冲液重新洗涤已活化的磁珠 3 遍后,再用 500ul 的偶联缓冲液洗涤磁珠磁珠 2 遍;加 475ul 偶联缓冲液重悬洗涤后的磁珠,再加入 25ul 6mg/ml 的抗 CD11a+ 抗体,使得磁珠表面活化的羧基同抗体 CD11a+ 抗体的氨基室温反应 3h,将抗体偶联磁珠表面,得到免疫磁珠。
  3. 封闭保存:用 500ul 的偶联缓冲液洗涤偶联磁珠 2 遍,加入 500ul 含有 1% 牛血清白蛋白(BSA)的偶联缓冲液封闭磁珠 30min;用 500ul 含 0.02%Na3N,0.1% 牛血清白蛋白(BSA)的 PH7.4,0.01mol/L 磷酸盐吐温(0.05%Tween—20)溶液重悬磁珠,保存 4℃ 冰箱,待用。
1.2细胞分离
  1. 将 Raji 细胞(阴性细胞,1*106/100ul)与 KG—1a 细胞(阳性细胞,1*106/100u)各 100ul 混合于 2ml 离心管;
  2. 加入 42ul 免疫磁珠(含抗体量为10ug),补加 158ul 含 1% BSA 的磷酸缓冲液(PBSS);
  3. 另一离心管中不加磁珠,只加 PBSS 为阴性对照,最后各管反应体积为 400ul,冰浴反应 45min;分离磁珠,分别收集阴性和阳性细胞,并重悬与 200ul PBSS中,各取 100ul 用 PBSS 洗 2 遍,重悬于 100ul PBSS 中,加入 100ul 偶联抗 CD11a+ 抗体的 FITC(含抗体量 2ug)进行标记,冰浴 45min,PBSS 洗 2 遍,用流式细胞仪检测各管细胞。
二、实验结果
  1. 磁珠偶联抗体量:≈52.4ug/mg
  2. 细胞分离结果:阳性细胞纯度约 91.71%;上清液阴性细胞纯度约 76.23%,阳性细胞回收率约 64.98%。
     
    备注:以上实验方法以及实验数据结果,皆参考于文献《简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备》,作者刘辉荣,徐宏,古宏晨等。

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